Interactions levures-levures : discrimination des populations et caractérisations métaboliques par fluorescence
Porteur(s) : Université de Bourgogne
Responsable(s) scientifique(s) : Géraldine Klein
Coût total : 43 990 €
Financeur(s) : Conseil Régional Bourgogne-Franche-Comté ; UMR PAM
Présentation
Ce projet vise à développer la thématique de l’étude des interactions entre levures ou entre bactéries et levures en environnement complexe tel que la matrice vin. La connaissance de la nature et des modalités de mise en place des interactions entre micro-organismes représente un enjeu important pour la filière vin, de même que de pouvoir distinguer les différentes souches constituant la population totale en cours de fermentation.
Les demandes de méthodes et de solutions sont d’autant plus importantes que la filière met en place de nouveaux itinéraires de bioprotection limitant les intrants tout au long du processus, de la culture à la vinification. Il devient indispensable de pouvoir suivre les populations de micro-organismes ainsi que les contaminants tout au long du processus. La demande en analyse et en caractérisation de ces populations est en développement constant dans notre région. Ce projet permettra de fournir des réponses à des problématiques de terrain qui portent sur (i) l’analyse rapide et polyvalente des populations et des déviations microbiologiques et (ii) la lutte contre la résurgence de problèmes liés aux modification des pratiques de vinification, notamment par la réduction des intrants (conservateurs…).
La cytométrie en flux est une méthode éprouvée et en plein essor pour mener à bien ces analyses et ces études d’interactions.
D’un point de vue fondamental, nous souhaitons utiliser la puissance des méthodes de cytométrie en flux couplé à des techniques de micro-fluidique et de microscopie pour étudier finement les interactions au niveau moléculaire. Les interactions ciblées peuvent être de plusieurs natures différentes avec ou sans contact entre cellules. Parmi les mécanismes à l’origine des interactions, il semble exister des phénomènes similaires au Quorum-sensing décrit chez les bactéries. Afin d’appréhender l’existence ou non de Quorum-sensing au sein du système, les molécules impliquées dans la communication cellulaire chez les levures comme les alcools aliphatiques ou les terpènes seront dosées. Mais surtout, afin d’étudier le rôle de ces molécules dans la communication cellulaire chez la levure, leur effet sera étudié au niveau cellulaire en couplant l’utilisation de gènes reporter et de modifications génomiques chez la levure. Cette stratégie permettra de suivre au niveau cellulaire les changements graduels de l’expression des gènes ciblés. Par ailleurs il sera également possible d’étudier les mécanismes de contact cellule-cellule entre levures. Pour mettre en évidence ces phénomènes, des fermentations compartimentées ont déjà été mises en place pour séparer physiquement les cellules dans un même milieu. L’apport de cellules modifiées dans certaines structures liées au contact cellulaire permettra de mieux comprendre ces phénomènes. La compréhension de ces mécanismes moléculaires permettra de définir des leviers d’actions à transmettre aux acteurs de la filière afin d’appliquer ces connaissances pour mieux contrôler l’impact des facteurs biotiques et abiotiques sur les fermentations et leur flore.
D’un point de vue applicatif, ce projet permettra de mieux comprendre les fermentations des levures indigènes, car en étudiant leurs comportements, les acteurs de la filière pourront mieux maîtriser leurs fermentations et mieux gérer leur production. Dans ce cadre, il est nécessaire de pouvoir distinguer les souches lors de co-ensemencement. La cytométrie permet de mesurer des niveaux de population grâce à la granulométrie, cependant en cas de souches morphologiquement proche il sera nécessaire de réaliser un marquage fluorescent des cellules. Ces méthodes de marquages peuvent être étendues à des marquages ciblés du métabolisme cellulaire permettant un suivi dynamique multiparamétrique en temps réel en une seule analyse. Pourront être contrôlés des paramètres tels que la viabilité, le stress oxydatif, la pH intracellulaire et d’autres voies métaboliques demandées par les professionnels. Par ailleurs l’étude des interactions entre micro-organismes pourra mener à étudier et mesurer l’impact des facteurs environnementaux et de la matrice au cours des fermentations.
Les objectifs et résultats du projet viseront, en fondamental, à comprendre les interactions levures-levures lors de la fermentation alcoolique, étudier la nature des interactions, appliquer les méthodes de transformation génétique afin de créer une banque de mutant levures. En appliqué, ils porteront sur le développement de méthodes de suivi multiparamétrique en temps réel par cytométrie, de protocoles de suivis dynamiques et de marquages fluorescents, la réalisation de cultures en variant les modes de co-cultures afin de moduler le contact ou la communication cellulaire entre Saccharomyces et non-Saccharomyces pour affiner les modèles d’interactions. En transversal, il s’agira d’identifier les facteurs environnementaux biotique et abiotiques constituant des leviers d’actions pour la maîtrise des fermentations.